陈苑秋，袁晓*，蒲含林*
暨南大学细胞生物学系广州牌牌生物科技有限公司
摘要：目的为药物中基因毒性杂质的分析方法开发及检测提供参考。方法查阅国内外文献，归纳与总结了液相色谱及液质联用技术在基因毒性杂质检测中的适用范围、特点与不足，并对其应用案例进行综述。结果与结论基因毒性杂质种类繁多，需根据结构特性及限度要求开发合适的分析方法。液相色谱及液质联用作为当代药物分析的重要手段，在基因毒性杂质分析中具有广阔的应用前景。
关键词：基因毒性杂质；液相色谱；液质联用；分析方法
ApplicationofLCandLC-MSinthedetectionofgenotoxicimpurities
CHENYuan-qiu,YUANxiao*,PUHan-lin*
Abstract：OBJECTIVEItprovidesaref,characteristicsandshortcomingsofliquidchromatographyandliquidchromatographymaethodssh,liquidchromatographyandthecombinationofliquidandmasshavewideapplicationprospectsintheanalysisofgenotoxicimpurities.
Keywords:Genotoxicimpurity;Liquidchromatography;Liquidchromatographymassspectrometry;Analyticalmethods
归纳了液相色谱及液质联用技术在基因毒性杂质检测中的适用范围、优点及不足，总结了近年来国内外采用液相色谱及质谱技术在基因毒性杂质检测中的应用，主要包括高效液相色谱-紫外检测法、高效液相色谱-二极管阵列检测法、超高效液相色谱法、二维液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法及超高效液相色谱-串联质谱法。
1.液相色谱法
1.1高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）
高效液相色谱法（HPLC）因具有分离效率高、成本较低等特点，而在药物杂质分析中得到广泛应用[3]。在可达到检测限度的情况下对常规限度较高，且对挥发性弱而紫外吸收强的基因毒性杂质可首选高效液相色谱法进行检测。
孙以乙腈:0.02mol/ml磷酸盐缓冲液（）（50:50）为流动相，在波长225nm下检测氢溴酸西序普兰中的对甲苯磺酸乙酯，LOD为0.0124μg/mL，LOQ为0.0256μg/mL[4]。需通过调整有机相的比例及流动相的pH以改善分离度，最终确定以乙腈：10mmol/ml磷酸二氢钠溶液（）（10:90）为流动相，在波长242nm下检测利伐沙班中的4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮，LOD为10.10ng/mL，LOQ为30.30ng/mL[5]。Griˇcar等以0.5g/LH3PO4-乙腈为流动相，在波长205nm下通过梯度洗脱程序对沙坦类药物（厄贝沙坦、坎地沙坦、缬沙坦）中的叠氮化物进行分析，LOD为0.17μg/g，LOQ为0.84μg/g[6]。谢等以0.1%醋酸溶液-乙腈为流动相，在波长286nm下通过梯度洗脱程序检测间苯三酚中的2,4-二氯苯酚及2,4,6-三氯苯酚，LOD均为0.5μg/mL，LOQ分别为1.5μg/mL和1.6μg/mL[7]。Luo等采用了HPLC-UV衍生化对氯霉素中的4-硝基苯甲醛进行测定，通过比较四种硝基苯瘟衍生化试剂，发现3-硝基苯肼与4-硝基苯甲醛在60℃乙腈-水（70:30）中反应30分钟，药物基质和衍生试剂的干扰明显减少，其衍生物的最大吸收波长显著红移至397nm，该方法的LOD及LOQ分别为0.009μg/mL、0.003μg/mL[8]。Zheng等在比较了硝基苯肼与硝基苯胺后，选择2-硝基苯肼作为衍生剂，对亲酯性药物中的芳香族与脂肪族酰氯进行衍生化分析，检测限的范围为0.01-0.03μg/mL[9]。
HPLC-UV操作简单、维护成本低，但对于无紫外吸收基团或紫外吸收弱的样品，需进行衍生化处理，且HPLC-UV在使用时只能选择固定的检测波长，不适用于最佳检测波长不确定的样品。
(小结评价一下HPLC-UV法的局限性或范围)
1.2高效液相色谱-二极管阵列检测法（HPLC-DAD）
二极管阵列检测器（DAD）可以对色谱峰进行光谱扫描、峰纯度鉴定，在方法研究中可快速选择最佳检测波长，在高效液相色谱分析中广泛使用，是物质鉴别的一种常用手段，已被证明是一种可靠的检测方法[10,11]。
García等在对氯芬斯汀芬地佐酯中的对甲苯磺酸甲酯（MPTS）、2-氯乙基对甲苯磺酸盐（CEPTS）进行检测时，发现MPTS出现峰强度下降的现象，且降解产物是一种未知的化合物，最终通过HPLC-DAD对MPTS的降解产物进行分析，得到与对甲苯磺酸匹配的保留时间与紫外光谱，从而确定是由于MPTS酯键发生降解而导致[12]。Soman等开发了一种简单、灵敏的HPLC-UV-DAD方法，通过直接进样的方式检测双原料药中的4-氨基-2-乙氧基-肉桂酸、4-氨基-2-乙氧基-肉桂酸乙酯、4-溴-3-甲氧基-硝基苯，LOD为0.09-0.6µg/mL[13]。Hou等建立了在温和条件下以2-硝基苯肼为衍生剂，测定药物中卤代酸（氯乙酸，溴乙酸，二氯乙酸，2-氯丙酸，2-溴丙酸和3-氯丙酸）残留量的方法，并采用HPLC-DAD进行分析，检测范围在0.02-–0.05μg/mL[14]。
HPLC-DAD可通过全波长扫描获得更全面的样品信息，很好地弥补了HPLC-UV检测波长单一的缺陷，并可根据光谱对未知化合物进行辅助定性。
(小结评价一下HPLC-DAD法与UV法的不同或优势)
1.3超高效液相色谱法（UPLC）
作为HPLC的衍生产品，UPLC的出现无疑为药物分析打开了新的大门。无论是分析速度、溶剂消耗量，还是色谱分辨率和灵敏度，UPLC都优于传统的HPLC[15,16]。
Abdelwahab等建立了一种在辅料苯扎溴铵的存在下稳定测定氮卓斯汀中苯甲酰肼的UPLC-UV方法，LOD和LOQ分别为1.62µg/mL、4.91µg/mL[17]。在检测盐酸沙格雷酯中的中间体环氧化物时，Wang等比较了柱切换高效液相色谱法和超高效液相色谱法，发现超高效液相色谱法的检测灵敏度更高，LOD和LOQ可达0.09ppm和0.18ppm，但由于盐酸沙格雷酯中间体的干扰，导致回收率较差[18]。
基于UPLC的优点，对于较难分离的基因毒性杂质可选择该法，且因其分离速度快、分析时间短，在方法优化时可节省大量时间。
(小结评价一下UPLC法的可能应用范围和优势)
1.4二维液相色谱法（2D-LC）
二维液相色谱，也称柱切换液相色谱，在一维液相的基础上通过添加一组切换阀和一个样品定量环而达到快速、高效分离复杂样品的目的，用于基因毒性杂质分析时，不仅自动化程度高，还可降低基质影响，提高检测灵敏度[19,20]。
为检测盐酸沙格雷酯中的中间体环氧化物，Wang等开发了一种简单经济的柱切换色谱法，即选择两根保留较弱的色谱柱以减少盐酸沙格雷酯中间体的残留，色谱柱1的作用是尽可能多地从系统中除去盐酸甲氧基胍中间体，并保留所有的环氧化合物杂质，色谱柱2的作用是分离从色谱柱1切换过来的少量盐酸沙格雷酯中间体和全部的环氧化物杂质，达到准确定量环氧化物杂质的目的，该方法的LOD可达0.33ppm[18]。结合超高效液相色谱以及二维液相的优点，对于基质效应严重的基因毒性杂质，2D-UPLC可提供新的思路。
2.液相色谱-质谱联用检测法
2.1高效液相色谱-质谱联用检测法（HPLC-MS）
对基因毒性杂质进行痕量分析时，需要一个可靠、灵敏度高且重现性高好的分析方法，这是对现代分析技术的一个重要挑战，仅使用液相色谱难以满足痕量分析，而液相色谱与质谱的联用很好地结合了液相色谱的多功能性及质谱的灵敏性[21]，使基因毒性杂质痕量分析可以准确地测定至ppm乃至甚至更低的水平。
张等在电喷雾电离源（ESI）正离子模式下，采用多反应离子监测模式（MRM）——离子对采集方式对氟胞嘧啶中的N,N-二甲基苯胺进行测定，LOD及LOQ分别为0.1ng/mL、0.4ng/mL[22]。Guo等采用液质联用技术，比较了电喷雾电离源（ESI）与大气压力化学电离源（APCI）两种电离技术对12种潜在基因毒性杂质（磺酸酯类）在检测能力上的差异，结果发现采用ESI源时，无论是正模式还是负模式，灵敏度与重现性都较差，并且难以改善，采用APCI源时，正模式下检测灵敏度较低，但在负模式下，可电离出稳定的子离子，准确度高，且在选择反应监测模式（SRM）SRM模式下可达到较低的检测限（2-4ng/mL）[23]。宋等建立了液相色谱-质谱法同时测定酒石酸伐尼克兰中6个类苯胺杂质，因其中4个杂质为同分异构体，质谱离子反应特征相同，因此通过优化流动相的pH及梯度洗脱程序使其有效分离，从而达到较高的的灵敏度，经过方法学验证，LOD及LOQ分别为15ng/mL、45ng/mL[24]。Székely等利用实验设计（DesignofExperiments，DOE）开发高效液相色谱串联质谱法对4-二甲基氨基吡啶（DMAP）痕量分析的方法，研究了流速、梯度、进样量三个液相条件及锥孔电压、碰撞能两个质谱参数，并根据分离度、峰面积、分析时间、信噪比进行色谱及质谱条件优化，其定量限可达0.1ppm[25]。Grigori等在检测美罗培南的三种潜在基因毒性杂质时，通过设置质谱切换阀将在三种杂质后出峰的美罗培南切换至废液，以减少原料对结果分析的干扰[26]。（补充总结式说明该方法的应用范围和优势）
不同于LC-UV/DAD，使用质谱时不需考虑化合物是否具有发色基团，质谱数据可提供如分子量、结构特性、纯度等有效信息[27]。当API中包含的其他杂质与目标基因毒性杂质在液相色谱中的保留时间相同或相近时，可能会对目标基因毒性杂质的测定产生干扰，若单独使用液相色谱可能无法作出准确判断，此时采用液质联用技术可以很好地排除这种干扰。
2.2超高效液相色谱-质谱联用检测法（UPLC-MS）
超高效液相色谱与质谱联用时可显著缩短检测时间及并减少溶剂使用量，提高离子质谱化效率并减小基质效应，使灵敏度和重现性提高[28]。
Venugopal在开发一种可同时测定利托那韦中三种苯酚杂质的UPLC-MS方法时，研究了不同稀释剂的色谱性能，发现用甲醇-水（40:60）作为稀释剂时可解决杂质响应低且峰形差的问题，减少了基质对灵敏度、回收率及重现性的影响，LOD可达0.03-0.1ppm，LOQ为0.1-0.3ppm[28]。Marija等在对齐帕西酮五种未知降解物进行定量测定及遗传毒性结构鉴定时，通过优化色谱条件对结构相似性较高的化合物进行分离，使七种化合物在七分钟的运行时间内完成洗脱，同时优化MS/MS裂解条件获得特定的裂解片段并提高信号强度[29]。Vijaya等开发出一种灵敏且选择性强的UPLC-MS/MS方法同时鉴定和定量佐米曲普坦中的四个PGI，解决了用HPLC分析该药物杂质时间长和分离效率低的问题[30]。（简单总结该方法的优缺点）
鉴于UPLC能有效分离和分析复杂的样品的优点，当HPLC-MS无法很好地分离含基因毒性杂质的复杂样品时，可考虑采用UPLC-MS。
2.3二维液相-质谱联用检测法（2DLC-MS）
考虑到流动相中的非挥发性添加剂对质谱的损害和污染，John等采用柱切换液相色谱分离技术通过不同的洗脱液对复杂混合物的成分进行分离，增强了质谱检测的能力，成功提高对低含量目标化合物的检测和表征[31]。3-硝基苯并蒽醌（3-NBA）是一种潜在基因毒性杂质，Hasei等开发了一种新的灵敏的分析方法，采用反相色谱和正相色谱组成的二维HPLC系统，通过反相色谱纯化3-NBA，用填充氧化铝的催化剂柱在乙醇中将非荧光的3-NBA还原成荧光3-氨基苯并蒽醌（3-ABA），但3-NBA在乙醇中不发荧光，因此，通过正相色谱将3-ABA与乙醇和杂质分离，并用荧光检测器进行定量检测[32]。（补充小结该法的优点和可能应用范围）
由于质谱对流动相成分的要求较高，使用二维液相色谱与质谱联用时可通过改变二维洗脱条件，避免第一维分离条件中的不挥发性添加剂等进入质谱，并减少其他杂质的干扰，提高质谱检测信号。
（能不能列个表总结一下各种方法的优缺点和使用范围？）
结语
随着液相色谱与液质联用技术的发展，其在基因毒性杂质检测中的应用越来越广泛。对基因毒性杂质检测进行方法开发时，需根据基因毒性杂质的其特性及限度需要要求选择合适的检测方法。，如需对基因毒性杂质进行痕量分析时，尽管液相色谱操作简便且维护成本低，但其检测限度可能无法满足要求，且原料中包含的其他杂质常常会对目标杂质产生干扰，容易出现假阳性或回收率差的问题，而质谱不仅灵敏度高且抗干扰能力强，将二者串联使用能达到更准确快速地分析。而二维液相色谱与质谱联用时，可有效避免流动相中的某些成分（如不挥发性盐、不挥发性酸等）对质谱的损坏及对pH对电离效率的影响。因此，液相色谱及液质联用作为当代药物分析的重要手段，在基因毒性杂质分析中具有广阔的应用前景。
现有方法的评价，是不是够用了，还有哪些不足之处或不能满足的方面。
适用范围
适用于常规限度、挥发性弱而紫外吸收强的基因毒性杂质
适用于最佳检测波长不确定的基因毒性杂质
适用于分析时间长且较难分离的基因毒性杂质
适用于基质效应严重的基因毒性杂质
适用于无发色基团或需痕量分析的基因毒性杂质
适用于难分离且分析时间长的复杂样品
适用于基质效应严重及需在含不挥发性盐流动相下分离的基因毒性杂质
优点
操作简单、维护成本低
1.可进行光谱扫描、峰纯度鉴定
2.可快速选择最佳检测波长
1.分析速度快、分析时间短
2.溶剂消耗量低
3.色谱分辨率高
1.自动化程度高
2.基质影响小，检测灵敏度高
1.不需考虑化合物是否具有发色基团
2.可排除API中与目标基因毒性杂质在液相色谱中保留时间相同或相近的其它杂质的干扰
1.分析速度快、分析时间短
2.溶剂消耗量低
3.色谱分辨率高
4.离子质谱化效率高
1.避免流动相中非挥发性添加剂对质谱的损害
2.降低交叉干扰、减少信号抑制
3.利用二维改变洗脱条件提高质谱检测信号
不足
1.只能选择固定的检测波长
2.对于无紫外吸收基团或紫外吸收弱的基因毒性杂质，需进行衍生化处理
对于无发色基团的基因毒性杂质，需进行衍生化处理
不适用于基质效应严重的基因毒性杂质
无法满足痕量分析
不适用于难分离的复杂样品
不适用于基质效应严重的基因毒性杂质
操作较繁琐
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